ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО СЕРОДИАГНОСТИКЕ ВИЧ, ВГС И СИФИЛИСА

Самые точные и качественные анализы методом ИФА и ПЦР в Узбекистане
НОВОСТИ | СОТРУДНИКИ | ССЫЛКИ | КОНТАКТЫ
НАВИГАЦИЯ
главная страница
информационные материалы
контроль качества
стандарты
услуги
для пациентов
достижения и проекты
выставка в ВДНХ
результаты испытаний
публикации
полезные статьи
партнёры и спонсоры
распространённость ТОРЧ инфекций
практические рекомендации
организация внутреннего контроля качества
организация внутрилабораторного контроля
паспорт
паспорт #2
коммерческое предложение

Rambler's Top100
Яндекс цитирования

оставить заявку на сдачу анализов

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО СЕРОДИАГНОСТИКЕ ВИЧ, ВГС И СИФИЛИСА МЕТОДОМ СУХОЙ КАПЛИ, НАНЕСЕННОЙ НА ФИЛЬТРОВАЛЬНУЮ БУМАГУ

ВВЕДЕНИЕ Антитела к ВИЧ могут быть обнаружены в цельной крови, которая наносит-ся на фильтровальную бумагу, а затем высушивается. Сухая капля крови (СКК) может использоваться для изучения распространения ВИЧ среди населения, для скрининга и подтверждения ВИЧ статуса у отдельных лиц. Образцы СКК очень удобны для скрининговых программ больших масштабов и эпидемиологи-ческого надзора. Преимущество этого метода в том, что используется капилляр-ная кровь (из пятки, пальца, уха), исключающая венопункцию. СКК не тре-бует замораживания, и образцы можно пересылать для исследований в цен-тральную лабораторию почтой. Для забора образцов СКК используется специальная фильтровальная бу-мага (Schlicher & Schuell 903 или Whatman BFC 180), которая рекомендована к использованию Всемирной Организацией Здравоохранения. Эта инструкция поможет работникам диагностических лабораторий при приготовлении образцов СКК и их исследовании в ИФА для определения антител к ВИЧ. При элюировании СКК получаются гемолизированные образцы, что тре-бует некоторых изменений в методике ИФА. В этой инструкции описаны методы элюирования (экстрагирования), разведения СКК и методы тестирования в ИФА образцов СКК, содержащих маленький объем сыворотки. Д.м.н. профессор Маткаримов Б.Д. БЕЗОПАСНОСТЬ При проведении исследований СКК на ВИЧ инфекцию все лаборатор-ные работники подвержены биологическому риску заражения. Доказано, что вирус иммунодефицита человека сохраняет жизнеспособ-ность в высушенном образце крови. Поэтому, работая со всеми образцами СКК необходимо соблюдать меры безопасности. Общие правила профилактики заражения ВИЧ инфекций в лаборато-рии 1. Необходимо использовать защитные средства, которые предотвращают попадание крови и других биологических жидкостей на кожу и слизистые оболочки: • Надевать перчатки, перед тем как брать кровь из вены. • Надевать перчатки, перед тем как брать кровь из пальца у подро-стков и взрослых и/или из пятки у новорожденных и детей. • Менять перчатки и мыть руки после каждого пациента. • Поместить все образцы крови и/или др. биоматериалы в специ-альный контейнер, который предотвратит их протекание при транс-портировке. Это защитит от контаминации сопровождающего, который доставляет биоматериалы в лабораторию. Внимание! Транспортировка СКК не представляет трудностей, поскольку образ-цы могут быть отправлены в бумажных конвертах. • Надевать перчатки при приеме и предварительной подготовке крови и/или др. биоматериалов для исследования. • Сменить перчатки и вымыть руки с мылом и водой после окон-чания работы с образцами. 2. Если на руки или на другой участок кожи попала кровь или другая биологическая жидкость, то необходимо этот участок немедленно и тщательно вымыть с водой и мылом. 3. Используйте специальный бокс, который предотвратит разбрызгивание капель биоматериалов при их предварительной подготовке. 4. Используйте в лаборатории механические пипетки при работе со всеми жидкостями. НЕ ПИПЕТИРУЙТЕ РТОМ! 5. Остерегайтесь от ранений иглами, скальпелями и другими острыми инструментами. • Не используйте повторно иглы, не снимайте иглы с одноразово-го шприца, не берите в руки поломанные или изогнутые иглы. • Использованные инструменты сбрасывайте в специальный закрытый контейнер. • Используйте шприцы и иглы только в том случае если это необ-ходимо. 6. Необходимо ежедневно обрабатывать рабочую поверхность в лабора-тории свежим дезинфицирующим раствором хлорной извести разведенной 1:10. Разведенную хлорную известь можно использовать в течение 24 часов. Можно так же использовать другие дезинфицирующие средства (разведение и их применение нужно смотреть в инструкции завода производителя). 7. Обработка оборудования контактирующего с кровью и др. биоматериа-лом: • Дезинфекция холодильников: тщательно вымыть, а затем об-работать раствором хлорной извести в разведении 1:10. • Дезинфекция центрифуги и ее компонентов: при помощи тампо-на обработать 80% этанолом. • Штативы для образцов необходимо автоклавировать или зама-чивать в течение 5 минут в растворе хлорной извести (1:10), а затем хорошо промыть водой. • Отработанные одноразовые расходные материалы выбрасыва-ют. Инструменты многоразового использования обрабатывают 80% этанолом. • Любую поверхность, которая находилась в контакте с биомате-риалом необходимо обрабатывать дезинфицирующим средст-вом не менее 5 минут при комнатной температуре. • Если лабораторное оборудование требует ремонта, то перед транспортировкой в мастерскую его необходимо вымыть и про-дезинфицировать. 8. Меры предосторожности в микробиологической лаборатории, при-меняемые к патологическим отходам, образцам крови и любым жидкостям со-держащие кровь: • Сжигайте или автоклавируйте все отходы, перед их захоронени-ем. Раствор, содержащий в своем составе, хлорную известь вы-зывает коррозию автоклава, поэтому перед автоклавированием, дез.раствор следует слить в канализацию. • После обеззараживания всю собранную кровь и др. биоматери-ал осторожно вылить в канализацию. 9. После работы тщательно вымыть руки. Снять защитные средства, перед тем как выйти из лаборатории. Меры безопасности, применяемые в случае, если биоматериал был разлит Необходимо обеззаразить разлившуюся кровь или другую биологическую жидкость: • Одеть перчатки. • Накрыть это место туалетной бумагой, залить раствором хлор-ной извести разведенной 1:10 и оставить на 5 минут. • Аккуратно собрать и выбросить эту бумагу в контейнер для от-ходов. • Вымыть это место раствором хлорной извести разведенной 1:10. ПРИГОТОВЛЕНИЕ СКК Фильтровальная бумага Для приготовления сухой капли необходимо использовать только такую специальную, предназначенную для этого фильтровальную бумагу как "Schleicher and Schuell Grade 903 Filter Paper" или "Whatman BFC 180 paper". Обычно на такой бумаге пунктиром обозначены кружки, на которые необходимо переносить образцы крови (рис. 1). Такой кружок может содержать примерно 100 мкл крови. Если же на бумаге такие кружки не обозначены, то необходимо наносить, такое количество крови, чтобы оно образовывало пятно диаметром около 1,5 см. Необходимые материалы • Медицинский халат • Стерильные одноразовые резиновые перчатки • Тампоны или салфетки, смоченные в 70% этаноловом или изо-пропиловом спирте • Сухие стерильные тампоны или салфетки • Стерильные скарификаторы • Фильтровальная бумага • Лейкопластырь бактерицидный • Ручка / маркер • Контейнер или пластиковый пакет для сброса инфекционно-опасных материалов (использованные тампоны, перчатки и т.д.) • Контейнер с жесткими стенками для сброса использованных скарификаторов • Дезинфектант (70% спирт или 6% перекись водорода) Процедура Подготовка пациента: • Успокойте пациента и сообщите, что вы собираетесь делать. Всегда обращайтесь с пациентом уважительно, с пониманием и сочувствием • Пациент будет чувствовать увереннее, если вы сами будете вы-глядеть уверенным в себе профессиональным специалистом Регистрация: • Занесите данные пациента в соответствии с установленными в вашей организации требованиями • Занесите необходимую информацию о пациенте в соответст-вующей графе на фильтровальной бумаге Выбор и обработка участка для взятия образца крови: • Вымойте руки с мылом • Спросите, является ли пациент левшой • Посадите пациента, так чтобы его нерабочая рука могла сво-бодно лежать на столе, за которым будет осуществляться взя-тие крови. • Убедившись в наличии всех необходимых материалов, распо-ложите их на столе рядом с собой. • Наденьте перчатки • Взятие крови не должно проводиться из указательного пальца или мизинца, так как ткань между кожей и костью на этих паль-цах очень тонка. • Выберите средний или безымянный палец, на котором нет поре-зов, гематом, признаков воспаления или сыпи. • Согрейте палец теплым полотенцем • Помассируйте палец мягкими движениями от его основания до кончика (5-6 раз). Это вызовет приток крови к месту прокола. • Оботрите подушечку последней фаланги пальца тампоном, смоченным 70% этиловом или изопропиловом спирте • Сотрите спирт сухим стерильным тампоном, так как остатки спирта могут усилить болевые ощущения, а также вызвать ге-молиз. Взятие образца крови • Возьмите одноразовый стерильный скарификатор, ни в коем случае не дотрагиваясь до его кончика • Другой рукой крепко держите палец пациента, так чтобы ваш большой палец был сверху и на значительном расстоянии от намечаемого места прокола • Одним твердым движением произведите прокол в зоне указан-ной на рис. 2, между центром подушечки и ее боковой стороной. Разрез ранки должен быть направлен перпендикулярно линиям отпечатка пальца, так как параллельный разрез часто вызывает растекание крови по ложбинкам на коже и препятствует образо-ванию большой капли • Сотрите первую каплю сухим стерильным тампоном или сал-феткой, прикладывая умеренное давление и мягко массируя палец, выдавите вторую большую каплю крови. Не следует сильно сдавливать палец, так как это может вызвать гемолиз. • Перенесите каплю крови на фильтровальную бумагу, так чтобы палец находился над центром кружка, обозначенного пунктиром и не касался при этом бумаги. • Круг должен быть ПОЛНОСТЬЮ заполнен образцом крови • Если крови оказалось не достаточно, чтобы полностью напол-нить круг необходимо немедленно добавить следующую боль-шую каплю. • Заполните полностью все необходимые круги на фильтроваль-ной бумаге. • Все капли наносятся только на одной стороне бумаги • Если на имеющейся у вас фильтровальной бумаге кружки не обозначены, то нанесите такое количество крови, чтобы оно об-разовывало пятно 1,5 см диаметром • Оставьте фильтровальную бумагу сушиться горизонтальном положении (см. ниже) • Закончив взятие крови, приложите стерильный тампон к ранке и надавите на нее, чтобы остановить кровотечение. Подержите некоторое время руку поднятой • Когда кровотечение остановится, наложите на ранку лейкопла-стырь. НЕЛЬЗЯ НАКЛАДЫВАТЬ ЛЕЙКОПЛАСТЫРЬ, ЕСЛИ КРОВОТЕЧЕНИЕ НЕ ОСТАНОВЛЕНО! • Сбросьте использованные материалы в соответствующие кон-тейнеры • Поблагодарите пациента • Снимите перчатки и вымойте руки Сушка образцов. Расположите бумагу с образцами крови так, чтобы она во первых находи-лась в более или мене горизонтальном положении, а во вторых чтобы обе ее стороны был открыты для циркуляции воздуха. Компания Schleicher и Schuell выпускает специальные картонные штативы для сушки биоматериала на фильт-ровальной бумаге, в штатив помещается 12 фильтровальных бумажек (рис. 3). Бумагу можно также подвесить между двумя книгами, закрепив ее края клейкой лентой. С помощью той же клейкой ленты можно прикрепить бумагу к краю лабораторного стола. ВАЖНО ПОМНИТЬ, что пятна крови не должны контактировать ни с поверхностью стола (книг, брусков), ни с клейкой лентой. Образцы должны быть высушены при комнатной температуре в течение как минимум 4 часов (и как минимум 24 часа в условиях высокой влажности). Внимание! Во время сушки нельзя подогревать образцы и складывать их в стоп-ки. Нельзя допускать контакта пятен крови с какими-либо предметами. ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВКА СКК Упаковка Высушенные образцы бумаги с СКК сложите так, чтобы каждый из них был с двух сторон закрыт листами кальки и не соприкасался с другим образцом. Для упаковки СКК используйте плотно закрываемые пакеты с низкой проницае-мостью воздуха. Упакуйте в каждый такой пакет по 10-15 СКК. Кроме того, в каж-дый пакет положите по 5-10 поглотителей влаги (для поглощения остатков влаги) Удалите воздух из пакета, и плотно закройте пакет. В случае избытка влаги в пакете индикаторы на пакетах с поглотителями влаги изменят цвет с голубо-го на розовый. Если такое произошло, то в пакете с образцами следует заме-нить поглотители влаги на новые. Поглотители влаги можно использовать по-вторно, после того как они просохнут в сушильном шкафу при температуре +65°С до тех пор пока их цвет их индикатора (тонкая полоска вдоль пакетов) снова не станет голубой. Затем достаньте их из сушильного шкафа и положить в отдель-ный пакет для запаса. Внимание! Пластиковые пакеты, используемые для хранения СКК должны иметь низкую проницаемость для воздуха и пластиковую застежку. Обычные пищевые пакеты не отвечают данным требованиям. Хранение образцов Упакованная СКК может храниться до 90 дней при 4°С. Доставать СКК из холодильника следует только перед исследованием. Для более длительного хранения (более 90 дней) образцы необходимо поместить в морозильную камеру с температурой минус 20° С. Транспортировка образцов Для того чтобы не повредить образцы при транспортировке необхо-димо их упаковывать в конверты или коробки с жесткими (например, картонны-ми) стенками. Транспортировка образцов должна производиться при температуре 4 °С или минус 20 °С. После того, как образцы прибудут в пункт назначения, не-обходимо достать пакеты с образцами из холодильника и оставить их при ком-натной температуре перед тем как открыть их. После того, как пакеты прогрелись до комнатной температуры, открыть пакеты и заменить использованные поглоти-тели влаги на новые. Посмотреть индикаторы влаги, если цвет не изменился, значит, образцы не имеют излишков влаги. Полученные образцы следует поло-жить в холодильник +4°С или заморозить при -20°С для дальнейшего хранения. ОЦЕНКА И РЕГИСТРАЦИЯ СКК Доставленные в лабораторию образцы должны пройти осмотр на качество капель и их упаковку. Все образцы должны быть упакованы в пластиковые пакеты с низкой проницаемостью воздуха. Между каждым из образцов должен находиться листок кальки. Не-обходимо просмотреть все фильтровальные бумажки и дать оценку качества СКК. Образцы плохого качества не исследуют. Внимание! Поглотители влаги с розовым индикатором следует заменить на новые. Все СКК доставленные в лабораторию должны быть зарегистрированы. Образцы, не подлежащие тестированию Образцы СКК не должны приниматься лабораторией для исследований если: • На бумаге образован сгусток крови • Кровь нанесена с двух сторон бумаги • Кровь не впиталась в бумагу полностью • Крови оказалось недостаточно, чтобы полностью заполнить обозначенные на бумаге кружки • Кровь из разных кружков слилась в одно пятно • Сыворотка на бумаге отделилась от тромбонизированных кле-точных элементов и образовала вокруг них светлые кольца • Пятна крови размыты или обесцвечены • Образцы не были до конца высушены перед отправкой в лабо-раторию (ярко красные пятна) ВЫРЕЗАНИЕ КРУЖКОВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ ИЗ ОБРАЗЦОВ СКК Если пакеты с СКК хранились при 4 °С или минус 20 °С, то все пакеты не-обходимо выдержать при комнатной температуре прежде, чем их открыть (ми-нимум 30 минут). Образцы СКК должны иметь комнатную температуру перед тем, как вырезать кружки. Кружки можно вырезать как с помощью канцелярского дырокола, так с помощью специального дырокола производимого компанией Schleicher & Schuell. После вырезания каждого кружка для того, чтобы предотвратить контами-нацию, необходимо удалять оставшиеся на инструменте волокна бумаги. АДАПТАЦИЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ СКК Элюирование СКК Для определения антител к ВИЧ в образцах СКК могут быть использованы тест-системы, которые применяются для определения антител к ВИЧ, ВГС и Treponema pallidum в сыворотке и плазме и отвечают установленным на-циональным требованиям по чувствительности и специфичности. Информация по тест-системам представлена в конце этого раздела. Общая инструкция по приготовлению элюата (экстракта) 1. Элюирование (экстракция) СКК следует проводить в ОДНОРАЗОВОМ плоскодонном планшете с крышкой (диаметр лунки должен быть 7 мм, а вырезанный кружок СКК - 6 мм). 2. Планшету для элюирования можно распланировать следующим образом: Лунки для контрольных образцов прилагаемых к тест-системе в планшете для элюирования необходимо оставить пустыми. Элюирование образцов СКК проводят в остальных лунках. В планшете для проведения анализа лунки распределяются в том же порядке. Образцы из одной планшету в другую можно переносить с помощью многоканальной пипетки. 3. Перед тем как вырезать кружки из образцов СКК необходимо написать протокол. 4. В каждую лунку внесите по 2 кружка от каждого образца СКК. 5. В каждую лунку внести по 200 мкл фосфатно-солевого буфера с 0,05% твином 20. Проверьте, чтобы в каждой лунке кружок полностью погрузил-ся в раствор и не плавал на поверхности. 6. Элюируйте в течение ночи при комнатной температуре. 7. Не храните элюат СКК больше 5 дней при температуре 4°С. Замоченные образцы не содержат антибактериальных веществ, поэтому возможен бактериальный пророст исследуемого материала. 8. Осторожно: бактериальный пророст может разрушить антитела, что приведет к ложноотрицательным результатам, или ведет к росту бактерии, что может привести к ложноположительным результатам. 9. Для повторных исследований образцов, имеющих низкую ОП можно однократно заморозить элюат СКК, что приведёт к незначительным изменениям в показателях. Для этого всю 96 луночную планшету накрыть крышкой, подписать, поместить в пакет и заморозить. Избегайте встряхивания и расплескивания, так как это приведет к кросс- контаминации из лунки в лунку и, соответственно, к ложным результатам. Приложение 1. Рекомендации Американских Центров по Контролю и Профилактике Забо-леваний (CDC/CAR) и Референс лаборатории Минздрава РУз по адаптации некоторых коммерческих ИФА тест-систем для обследования образцов СКК на наличие анти-ВИЧ, анти-ВГС и анти-Т. pallidum. Внимание, для тест-систем различных форм используются различ-ные модификации, отработанные при параллельном исследовании образцов СКК и сывороток венозной крови. Тест-системы, не указанные в последующем списке требуют дополнительных исследований и не должны использовать-ся в практической службе до их окончания. 1. Диагностическая тест-система «Рекомбинант анти-ВИЧ-1,2 ДСМ» Медико-Биологический Союз, Новосибирск, Россия Вместо сыворотки/плазмы в лунки вносят равное количество элюата СКК. Далее анализ проводится в полном соответствии с Инструкцией производителя 2. Диагностическая тест-система «ИФА АНТИ-ВГС» Производитель - Диагностические Системы, Нижний Новгород, Россия Вместо сыворотки/плазмы в лунки вносят равное количество элюата СКК. Далее анализ проводится в полном соответствии с Инструкцией производителя 3. Диагностическая тест-система «ИФА АНТИ-ЛЮИС» Производитель - Диагностические Системы, Нижний Новгород, Россия В лунки вносят по 90 мкл элюата СКК и 10 мкл раствора для раз-ведения сывороток, входящего в состав данной тест-системы. Далее анализ проводится в полном соответствии с Инструкцией производителя 4. Диагностическая тест-система «MurexHIV 1.2.» Производитель - Abbott Murex, Dartford, UK В лунки вносят по 75 мкл элюата СКК и 25 мкл раствора для раз-ведения сывороток входящего в состав данной тест-системы. Далее анализ про-водится в полном соответствии с Инструкцией производителя 5. Диагностическая тест-система «Murex Anti-HCV» Производитель - Abbott Murex, Dartford, UK В лунки вносят по 50 мкл элюата СКК и 150 мкл для раствора для разведения сывороток. Далее анализ проводится в полном соответствии с Инструкцией производителя 6. Диагностическая тест-система «Ortho HCV 3.0 SAVe» Производитель - Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, USA В лунки вносят по 100 мкл элюата СКК и 100 мкл для раствора для раз-ведения сывороток. Далее анализ проводится в полном соответствии с Инструк-цией производителя 7. Диагностическая тест-система «Murex Syphilis» Производитель - Abbott Murex, Dartford, UK В лунки вносят по 75 мкл элюата СКК и 25 мкл для раствора для раз-ведения сывороток. Далее анализ проводится в полном соответствии с Инструк-цией производителя




© 2007-2009 RefLab.info | Все права защищены.
Использование любых материалов размещённых на нашем сайте - запрещено без согласия с администрацией и без обратной ссылки вида
Лабораторная Диагностика