РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОРГАНИЗАЦИИ ВНУТРИЛАБОРАТОРНОГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА

Самые точные и качественные анализы методом ИФА и ПЦР в Узбекистане
НОВОСТИ | СОТРУДНИКИ | ССЫЛКИ | КОНТАКТЫ
НАВИГАЦИЯ
главная страница
информационные материалы
контроль качества
стандарты
услуги
для пациентов
достижения и проекты
выставка в ВДНХ
результаты испытаний
публикации
полезные статьи
партнёры и спонсоры
распространённость ТОРЧ инфекций
практические рекомендации
организация внутреннего контроля качества
организация внутрилабораторного контроля
паспорт
паспорт #2
коммерческое предложение

Восстановление волос методом пересадки волос в центре Тализи
Rambler's Top100
Яндекс цитирования

оставить заявку на сдачу анализов

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОРГАНИЗАЦИИ ВНУТРИЛАБОРАТОРНОГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА В ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ.

ТЕРМИНОЛОГИЯ И ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ. Внутрилабораторный контроль качества (ВКК) – это проводимое сотрудниками лаборатории постоянное слежение за всеми этапами лабораторной работы, позволяющие решить вопрос о возможности передачи получаемых результатов врачам-специалистам. Принцип проведения ВКК для ИФА лабораторий достаточно прост: при каждой постановке анализа вместе с образцами сывороток пациентов нужно 3 проводить измерение одного и того же контрольного материала, а результаты этих измерений заносить в контрольную карту Shewhart. В качестве контрольного материала для внутреннего контроля используется, как правило, внутрилабораторный стандарт (ВЛС), который (в отличие от международных или национальных стандартов) может быть приготовлен в лаборатории самостоятельно. Референс-образец HBsAg-положительной сыворотки – сыворотка с установленным содержанием HBsAg, аттестованная в референтной тест- системе “Ortho Diagnostic Systems”, тест-системах “Sanofi”, “Dia-Sorin” и откалиброванная по HBsAg-стандарту ay-субтипа, предоставленному Центром по Контролю над Заболеваниями (CDC, США). Не содержит антител к ВГС, ВИЧ и Treponema pallidum (сифилис). Референс-образцы производятся в Референс лаборатории МЗ РУз. Точность измерений – качество, отражающее близость результатов к истинному значению измеряемой величины, при котором малы все виды погрешностей - систематические и случайные. Правильность - качество, отражающее близость к нулю систематических погрешностей, т.е. соответствие среднего значения результатов с истинной величиной измеряемого параметра. Воспроизводимость – качество, отражающее близость друг к другу результатов измерений, выполненных в разных условиях. 4 Глава I. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ВНУТРИЛАБОРАТОРНОГО HBsAg- СТАНДАРТА. § 1. Биологический материал. В качестве материала для приготовления ВЛС рекомендуется использовать сыворотку крови. Так как плазма имеет тенденцию быть неустойчивой при хранении и может самопроизвольно свертываться, особенно после замораживания или оттаивания. Чтобы разрешить эти проблемы, плазму можно рекальцифицировать. § 2. Конверсия плазмы в сыворотку. Рекальцификация – небезопасная и технически трудная операция, которую следует выполнять в боксе, с соблюдением всех правил работы с патогенным биоматериалом I-II группы. 1. Приготовьте раствор CaCl2*2H2O с концентрацией 2 мол/литр. Для этого растворите 3 г CaCl2*2H2O в 10 мл дистиллированной воды. 2. Добавьте 0,5 мл свежеприготовленного раствора CaCl2 к 100 мл плазмы, перемешайте и выдержите на водяной бане при 37 °С в течении 1 часа. Для коагуляции больших объемов может потребоваться 2-3 часа. 3. Если плазма не свернулась, то можно добавить еще 0,25 мл CaCl2 (на 100 мл плазмы) и продолжить инкубацию. 4. Когда плазма свернулась, достаньте ее из водяной бани, охладите, поставьте флакон и поместите в морозильную камеру, желательно при температуре ниже минус 20 °С на всю ночь. Во время замораживания и размораживания плазмы необходимо использовать флаконы из термоустойчивого стекла. 5. Достаньте флакон из морозильной камеры, дайте растаять при комнатной температуре и отделите сыворотку от фибринового сгустка. Для малых объемов при использовании пакетов для сбора разделение можно выполнить с помощью центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 минут. § 3. Приготовление ВЛС. Для наиболее надежного надзора за качеством выполняемых исследований в высококлассных лабораториях при каждой постановке анализа измеряются показатели сразу 3-х внутрилабораторных стандартов: сыворотка, не содержащая HBsAg; сыворотка с низким содержанием HBsAg; и сыворотка с высоким содержанием HBsAg. Однако для ВКК также допускается использовать один ВЛС с низким содержанием HBsAg. Приготовление ВЛС с низким содержанием HBsAg. Референс лаборатория МЗ РУз распространяет референс-образцы сывороток с низкой концентрацией HBsAg (. 1 нг/мл). 5 Данный референс-образец является калибровочным материалом, необходимым для выбора или приготовления внутрилабораторного стандарта в достаточном для проведения повседневных исследований объеме (> 20 мл). ВНИМАНИЕ!!! Объем предоставляемого референс-образца – 1 мл, поэтому он не может быть использован для ВКК. ВЛС с низким содержанием HBsAg можно приготовить разведением сыворотки с высоким титром HBsAg сывороткой, не содержащей HBs-антиген. Требования к используемым сывороткам. Сыворотка Требование HbsAg-положительная ОП >> 3 оптических единиц HbsAg-отрицательная а) отсутствие антител к HBsAg* б) достаточный объем (обычно >20 мл)** ВАЖНО!!! * Если сыворотка будет содержать антитела к HBsAg, то при ее добавлении к HBsAg-положительной сыворотке, все HBsAg-частицы окажутся связанными антителами. ** Когда HBsAg-отрицательной сыворотки оказывается недостаточно, можно использовать пул из нескольких сывороток, не содержащих HBsAg и антитела к HBsAg. Если у Вас нет диагностикумов для обнаружения анти-HBs, то HBsAg- отрицательную сыворотку можно приобрести в Референс лаборатории МЗ РУз, аттестованную в референтных тест-системах “Ortho” и “Abbott” и не содержащую ни один серологический маркер на вирусные гепатиты и ВИЧ. Поэтому данную сыворотку можно также использовать при приготовлении внутрилабораторных стандартов на анти-ВГС и анти-ВИЧ. Ниже приводится общая схема разведений сывороток с высоким содержанием HBs-антигена в пуле отрицательных сывороток, принятая в Референс лаборатории МЗ РУз для начальных этапов приготовления референс-образцов. 6 Примерная схема разведений и т.д. до разведений 1/1000; 1/10000 Если это необходимо, можно приготовить разведения «1/2000» и «1/5000» для этого нужно к 100 мкл сыворотки «1/1000» добавить соответственно 100 или 400 мкл HBsAg-отрицательной сыворотки. После того как Вы выбрали разведение, в которых оптическая плотность при постановке ИФА близка к стандарту, необходимо приготовить его в количестве достаточном как минимум для 100 постановок (>20 мл). Рекомендуем это делать также поэтапно. перемешать 20-30 раз 7 Например, для приготовления 20 мл сыворотки «1/10000»: к 0,2 мл (200 мкл) сыворотки «1/100» добавить 1,8 мл HBsAg-отрицательной сыворотки. Тщательно перемешать (20-30 раз). К полученным 2 мл сыворотки добавить еще 18 мл HBsAg-отрицательной сыворотки и опять тщательно перемешать. Если же сразу разводить 2 мкл цельной HBsAg-положительной сыворотки в 19,998 мл HBsAg-отрицательной сыворотке, то вероятнее всего произойдет неравномерное распределение антигена и в одних пробах его окажется больше, а в других, соответственно, меньше. § 4. Хранение. Во избежание повторного замораживания и оттаивания, которые могут привести к деградации антигена, полученную сыворотку следует разаликвотить по 200 мкл (объем достаточный для одной постановки анализа). Внутрилабораторные стандарты должны храниться при температуре от минус 20 °С до минус 40 °С. Глава II. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ПОГРЕШНОСТЕЙ. §1. Построение контрольных карт Для повседневного контроля проводимых иммуноферментных анализов можно использовать метод контрольных карт Шухарта (Рис. 1). 1. Приготовленный Вами внутрилабораторный стандарт нужно измерять так же, как и обычные сыворотки, через каждые 20-40 проб пациентов. 2. Определить в каждой постановке величину Х = ОП/ОПкрит 3. После того, как Вы 20 раз определили величину Х, найдите среднее арифметическое значение Хср. Хср = Х1+Х2+Х3 +…+Х20 / 20 4. Рассчитайте стандартное отклонение (. или SD). Согласно формуле: . = . (Xi - Xcp)2 n-1 В данном случае, . будет равна: (Х1 – Хср)2 + (Х2 – Хср)2 + …+ (Х20-Хср)2 19 5. Определите предупредительные границы Хср - 2. и Хср + 2. 8 6. Определите контрольные границы карты Хср - 3., Хср + 3. 7. Постройте карту (Рис. 1), нанеся Хср в качестве центральной линии карты и параллельно ей две предупредительные (Хср ± 2.) и две контрольные границы (Хср ± 3.), и начинайте работать, отмечая на карте день постановки и величину ОП внутрилабораторного стандарта. 8. Если после построения карты один результат будет находиться за предупредительными границами (Рис. 1), необходимо исключить данный результат из расчетов и заново пересчитать величину . по оставшимся 19 результатам, которая будет равна: (Х1 – Хср)2 + (Х2 – Хср)2 + …+ (Х19-Хср)2 18 Рисунок 1. Построение Карты Шухарта 7. Если после построения карты сразу несколько результатов будут находиться за пределами Хср ± 2., необходимо приостановить анализы и принять меры для выявления и исключения ошибок. §2. Оценка контрольных карт. Если воспроизводимость и правильность проводимых измерений сохраняются на неизменном уровне, то получаемые результаты должны приблизительно поровну располагаться по обе стороны от среднего значения (Рис. а), не должны непрерывно нарастать или убывать (Рис. б) и не должны сильно отклоняться от среднего значения (Рис. с). 9 Оценку контрольных карт можно проводить, руководствуясь правилами Westgard или критериями Buttner, которые представлены на следующих таблицах: 10 Контрольные правила Westgard. Правило Определение Тип ошибки 12SD Один контрольный результат вышел за пределы Хср ± 2. Случайная Сигнал для применения других критериев. Например, критерии Buttner 13SD Один контрольный результат вышел за пределы Хср ± 3. Случайная R4SD Разница между максимальным и минимальными контрольным результатами превышает 4. Случайная 22SD Два последовательных измерения вышли за пределы Хср - 2. или Хср + 2. Система- тическая 41SD Четыре последовательных измерения вышли за пределы Хср - 1. или Хср + 1. Система- тическая 10X Десять последовательных измерений лежат по одну сторону от средней линии (Хср) Система- тическая 11 Критерии Buttner. Предупредительные критерии 1 6 результатов подряд находятся по одну сторону от линии Хср 2 3 результата подряд находятся за пределами Хср ± 1. 3 1 результат находится за пределами Хср ± 2. Контрольные критерии 1 8 результатов подряд находятся по одну сторону от линии Хср 2 4-5 результатов подряд находятся за пределами Хср ± 1. 3 3 результата находятся за пределами Хср ± 2. 4 1 результат находится за пределами Хср ± 3. Если Ваши результаты соответствуют предупредительным критериям, необходимо тщательно проанализировать все этапы работы. Такие результаты можно выдавать больному или врачу, но необходимо проверить весь ход аналитического процесса. При появлении результатов, соответствующих контрольным критериям, анализы задерживаются и принимаются меры для выявления и исключения ошибок. Глава III. ОСНОВНЫЕ ИСТОЧНИКИ ОШИБОК. ИХ ВЫЯВЛЕНИЕ, УСТРАНЕНИЕ И ПРЕДОТВРАЩЕНИЕ. § 1. Тест-система. Обычно врачи-лаборанты склонны объяснять плохое качество анализов несовершенством используемых тест-систем. Однако как показывают результаты первого тура Национальной программы внешней оценки качества в диагностических лабораториях Республики, источниками ошибок чаще оказываются: • нарушение инструкции по применению тест-систем; • ошибки пипетирования, связанные, как правило, с отсутствием навыков работы с автоматической пипеткой; • использование некалиброванных или даже неисправных инструментов (автоматических пипеток, мультисканов); • многократное использование одноразовых наконечников без соответствующей обработки; Тем не менее, в виду того, что любая постановка ИФА начинается с приобретения тест-систем, следует указать некоторые правила приема и хранения тест-систем: 1. проверьте комплектацию набора в соответствии с паспортными данными; 2. изучите инструкцию к применению и следуйте всем указанным требованиям, гарантирующим качественную работу тест-системы; 3. отметьте для себя параметры чувствительности и специфичности используемой тест-системы; 4. убедитесь в том, что срок годности тест-системы не вышел или не на исходе; Действительное качество приобретенной тест-системы определяется исследованием все того же внутрилабораторного стандарта и ведением контрольной карты, которая, кстати, в случае обращения к фирме- производителю с рекламацией, будет Вашим наиболее весомым аргументом. § 2. Исследуемая сыворотка (плазма). Исследуемая сыворотка (плазма) может зачастую оказаться источником неправильных результатов в случае: • контаминации при приготовлении сыворотки - переноса HBs-антигена из зараженного образца в незараженный образец при обведении крови стеклянной палочкой; • длительного хранения образцов с низким содержанием HBsAg; 15 • индивидуальных особенностей самой крови (большое содержание фибриногена, наличие антител, реагирующих с моноклональными антителами мыши); Для того, чтобы избежать ошибок на стадии приготовления проб предлагаем центрифугировать полученную кровь при 3000 об/мин в течение 10 мин, а затем термостатировать при 37 .С в течение 30 мин для скорейшего формирования фибринового сгустка. § 3. Оборудование. Метрологический контроль и обслуживание. Как видно из приведенных в предыдущей главе примеров по оценке контрольных карт, наиболее вероятным источником систематической ошибки в проводимых измерениях считается лабораторное оборудование. Применительно к ИФА-диагностике, при появлении систематической ошибки обычно рекомендуется: 1. провести калибровку автоматических пипеток; 2. проверить состояние спектрофотометра (мультискана, унискана); 3. проверить работу термостата; Для проверки работы термостата достаточно поместить на полке (где лежит плашка) дополнительный контрольный термометр. При наличии разницы, термостат следует перенастроить по контрольному термометру. Техническое обслуживание спектрофотометра требует наличия специальных знаний. Поэтому наиболее правильным шагом, в данном случае, будет привлечение специалиста. Вместе с тем, для спектрофотометра (такого например, как распространенный в нашей стране унискан фирмы «Bio-Tek») со светофильтрами вставляемыми снаружи, а стало быть контактирующими с пылью, влагой или даже пальцами лаборантов, рекомендуется регулярно протирать линзы светофильтров фланелью, смоченную эфиром. Если же светофильтры находятся внутри аппарата, эта операция является излишней. Калибровка автоматических пипеток. I. Периодичность. Пипетки должны проверятся 1 раз в полгода или каждый раз, когда качество проводимых исследований оказывается не удовлетворительным. II. Тип пипеток. Пипетки с фиксированным объемом калибруются по заданному объему. Пипетки с регулируемым объемом калибруются по двум точкам: по минимальному и максимальному объемам пипетки. Например, чтобы оценить 16 состояние пипетки объемом 20-200 мкл, необходимо установить насколько точно она «набирает» 20 мкл и насколько точно она «набирает» 200 мкл. III. Материалы. • весы аналитические • термометр • вода дистиллированная • новые чистые наконечники • чистые пенициллиновые флаконы • протоколы калибровки IV. Методика (упрощенная). Измерьте температуру воды, определите по таблице 1 коэффициент Wt. Занесите данные в формуляр. Проверяйте температуру через каждые 2 часа .. Отметьте в формуляре емкость и номер пипетки .. Поставьте пенициллиновый флакон на весы .. Уравновесьте весы .. Если пипетка с регулируемым объемом, то установите минимальное значение объема. .. Наберите воду пипеткой и слейте ее во флакон, стоящий на весах. .. Отметьте вес в формуляре .. Уравновесьте весы. .. Опять наберите воду и измерьте ее вес. Общее количество измерений - 6 раз. .. Если пипетка с регулируемым объемом, то установите максимальное значение объема и повторите процедуру. 17 V. Вычисления. 1. Определите средний вес: mср = (m1 + m2 + m3 + m4 + m5 + m6 ) / 6 .. 2. Определите емкость пипетки: Сm = mср . Wt) .. 3. Определите процент погрешности, которую делает пипетка относительно номинального объема Сn: E = (Cm-Cn) . 100 / Cn .. 4. Допустимая погрешность: ± 5 % для пипеток объемом 1 - 50 мкл ± 3 % для пипеток объемом > 50 мкл .. 5. Если погрешность превышает указанные пределы, то следует ее отрегулировать и повторить процедуру калибровки. Если пипетку невозможно починить, то пользоваться ею больше нельзя. Данные калибровки заносятся в специальные формуляры. (см. Приложение 1 и 2). § 4. Наконечники для автоматических пипеток. Многократное использование (часто в течении нескольких лет) одних и тех же разовых наконечников является, пожалуй, одной из основных проблем ИФА-диагностики в Узбекистане. В виду того, что на сегодня большинство лабораторий не в состоянии постоянно приобретать новые наконечники, мы здесь приводим методику обработки наконечников, которая при наиболее эффективной отмывке наименее деформирует их. • замачивание в 3%-6% перекиси водорода, можно с 0,5% жидкого моющего средства (типа жидкости для мытья посуды серии “Клер” по ТУ 2383-001- 26332142-99) или хозяйственного мыла (50г на 10 л воды) на 24 часа • категорически запрещается использовать СМС в виде любых стиральных порошков! • промывка 10 раз холодной водой • промывка 2 раза дистиллированной водой • кипячение в третьей порции дистиллированной воды не менее 40 минут 18 • сухожар 80° С не менее 5 – 6 часов до полного высыхания или автоклавирование 20 мин при 121° С, 1 атм или поместить в 70% спирт не менее, чем на 2 часа • раскладка наконечников в штативы пинцетом! § 5. Навык работы с автоматической пипеткой. Для того чтобы оценить насколько Вы точно работаете с пипеткой, проведите следующий эксперимент. • Использованный планшет поместите на несколько часов в сосуд с 6% перекисью водорода (для обеззараживания). Затем, промойте его проточной и дистиллированной водой, и высушите. Убедитесь, что дно всех лунок одинаково чистое. • Растворите таблетку ОФД в 10 мл дистиллированной воды и оставьте на несколько часов на освещенном месте. После того, как раствор приобретет темно желтый цвет раскапайте по 200 мкл в лунки планшета. • Просчитайте, с помощью мультискана, оптическую плотность раствора в лунках. • Найдите среднюю арифметическую оптическую плотность (ОПср). Если отклонения от ОПср в отдельных лунках находятся в пределах 8%, значит, Вы достаточно точно работаете с пипеткой. Если же погрешность больше 8% - советуем потренироваться в данном упражнении до получения оптимальных результатов. § 6. Постановка ИФА. Необходимо всегда помнить, что главным гарантом качественной постановки иммуноферментного анализа является строгое выполнение всех условий, указанных в инструкции используемой тест-системы. Тем не менее, ниже приводятся несколько правил постановки, обычно неупоминаемых в инструкциях, однако несоблюдение которых может привести к возникновению ошибочных результатов. • продолжительность нанесения сывороток и/или коньюгата в лунки планшета не должна превышать 30% от времени последующей инкубации; • не отбирать ошибочно внесенную сыворотку из лунки, чтобы внести новую; • устанавливать и контролировать требуемую температуру в термостате; • строго соблюдать время иммунологической и ферментативной реакций; • поддерживать в помещении, где проводят анализы, температуру 20-25 °С; 19 §7. Учет результатов. Как показывает практика неправильные результаты могут возникать также и на стадии их учета. Причиной ошибки при этом может явиться попавшая в лунку соринка, «запотевшее» дно планшеты или же лунка с дефектом пластика. В связи с этим настоятельно рекомендуется: • использовать программы учета, указанные в инструкции к тест-системе (наличие "бланка", вычитание поглощения на длине волны 620 нм, использование соответствующих фильтров); • протереть фланелью дно планшеты перед учетом результатов; • всегда сверять результаты, выданные прибором, с визуально видимым окрашиванием в соответствующих лунках планшета; • отмечать лунки с дефектом пластика или попавшей соринкой, так как это, как правило, приводит к увеличению оптической плотности сигнала в данной лунке;




© 2007-2009 RefLab.info | Все права защищены.
Использование любых материалов размещённых на нашем сайте - запрещено без согласия с администрацией и без обратной ссылки вида
Лабораторная Диагностика